ウエスタンブロットの手順
ウエスタンブロットは、組織から抽出した特定のタンパク質を同定するための代表的な手法です。まず、SDS‑ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を電荷と分子量で分離し、ニトロセルロース膜へ転写します。転写後、目的タンパク質に特異的に結合する標識抗体で染色し、X線フィルムや専用のイメージング装置で可視化します。以下では、複雑なタンパク質研究に適した実験室での基本的なウエスタンブロット手順を紹介します。
必要なもの
- SDS‑ポリアクリルアミドゲル（SDS‑PAGE）で分離したタンパク質
- ニトロセルロース膜
- 蒸留水
- 転写バッファ（30 g Tris、144 g グリシン、200 ml メタノールを 1 L 水に溶解）
- フィルターペーパー（Whatman 3 mm）
- 実験用スポンジ
- ウエスタンブロット転写チャンバー
- 電源装置
- 冷蔵庫
- アジテーター
- Tris 緩衝食塩水（TBS）（24.2 g Tris塩基、80 g NaCl を 1 L 水に溶解）
- ブロッキング溶液（5 % 脱脂粉乳を TBS に溶解）
- 一次抗体溶液
- 標識抗体コンジュゲート溶液
- 窒素青テトラゾリウム染色を含むアルカリホスファターゼ基質溶液
- リン酸緩衝食塩水（PBS）
- ゲルイメージングボックス
手順
1. タンパク質のニトロセルロース膜への転写
- 膜を蒸留水に2分間浸し、続いて転写バッファに5分間浸す。
- スポンジ／フィルターペーパー／SDS‑PAGEゲル／ニトロセルロース膜／フィルターペーパー／スポンジの順に積み重ね、膜側を陽極（アノード）側、ゲル側を陰極（カソード）側に配置する。
- 転写バッファでサンドイッチ全体を浸し、チャンバーを4 °Cの冷蔵庫に入れて保持する。
- 電源を30 V、40 mAに設定し、夜間（約12時間）転写を行う。大きなタンパク質ほど速く移動する。
- 転写完了後、電源を切り、電源装置に接続したままバッファやサンドイッチに触れないように注意する。
- 膜をサンドイッチから取り出し、ブロッキング溶液で2時間インキュベートし、非特異的結合部位を遮断する。
2. 抗体の結合
- 一次抗体溶液に膜を完全に沈め、アジテーターで最低1時間（過夜でも可）インキュベートする。
- TBSで10分間を4回行い、未結合の一次抗体を洗い流す。
- 標識抗体コンジュゲート溶液に膜を沈め、アジテーターで最低1時間インキュベートする。標識抗体はアルカリホスファターゼと結合している。
3. タンパク質の検出
- PBSで10分間を4回洗浄し、余分な標識抗体コンジュゲートを除去する。
- アルカリホスファターゼ基質溶液に膜を浸し、バンドが現れるまで（即時～30分）反応させる。染料が抗体‑抗原‑タンパク質複合体に結合し、暗色のバンドが形成される。
- 膜をセルロースフィルムで包み、ゲルイメージングボックスに直接置いて画像を取得する。