ウエスタンブロットの指示
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必要なもの
- SDS-polyacrylamideゲル（SDS-PAGE）を分離したタンパク質
- ニトロセルロース膜
- 蒸留水
- トランスファーバッファー（30 gのトリス、144 gのグリシン、1 L水中の200 mLメタノール）
- 濾紙、whatman 3 mm
- 実験室スポンジ
- ウエスタンブロット転送チャンバー
- 実験電源
- 実験室冷蔵庫
- Laboratory Agitator
- トリス緩衝生理食塩水溶液（TBS）（24.2 g Trisベース、1 Lの水中80 g NaCl）
- ブロッキングソリューション（TBSの5％の非脂肪粉末牛乳）
- 一次抗体溶液
- 標識抗体コンジュゲート溶液
- ニトロブルーテトラゾリウム染色によるアルカリホスファターゼ基質溶液
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
- gel-imagerボックス
手順
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タンパク質をニトロセルロース膜に移します
- 1
ニトロセルロース膜を準備します。膜を蒸留水に2分間浸し、移動バッファーに入れて5分間浸します。
- 2
スポンジ/濾紙/SDSページ/ニトロセルロース膜/濾紙/スポンジで構成されるトランスファーサンドイッチを組み立てます。 サンドイッチが整列されているため、膜がアノードの近くにあり、転送チャンバー内のカソードに近いゲルがあります。
- 3
サンドイッチが水没しているように、チャンバーに移動バッファーを追加します。チャンバーを実験用冷蔵庫の中に置きます。ゲルから膜へのタンパク質の移動は、摂氏4度で実行する必要があります。
- 4
電源をセットアップして、ゲルから膜にタンパク質を伝達します。転送方向は、赤い鉛によって示されるアノードに向かっています。より大きなタンパク質は、電流に応じてより迅速に移動し、最初に移動します。電源は転送速度を制御します。一晩転送するために、電力を30 Vと40 MAに設定します。
- 5
転送後に電源を分解します。電源が取り付けられているときに、転送バッファーと連絡を取りたり、サンドイッチを取り外さないでください。
- 6
サンドイッチから膜を取り外し、ブロッキング溶液で2時間インキュベートします。ブロッキング溶液中のタンパク質は、タンパク質が存在しない膜に吸収されます。それは、抗体が目的のタンパク質が存在しない膜に結合するのを防ぎます。
抗体を結合します
- 7
アジテーターを使用して、一次抗体溶液とニトロセルロース膜をインキュベートします。膜は、少なくとも1時間、溶液に完全に水没する必要があります。一晩インキュベートすることは許容されます。
- 8
膜を徹底的に洗浄して、固定抗体を除去します。通常、過剰な抗体を除去するには、TBSでの4つの別々の10分間の洗浄で十分です。
- 9
アジテーターを使用して、標識抗体コンジュゲート溶液で膜をインキュベートします。膜は少なくとも1時間インキュベートする必要があります。標識された抗体コンジュゲートは、アルカリホスファターゼに結合しています。最初の抗体を認識して結合するのは、酵素抗体ミックスです。
タンパク質の検出
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PBSで膜を10分間4回すすぎます。これにより、標識抗体コンジュゲートの残りの部分が除去されます。
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バンドパターンが表示されるまで、アルカリホスファターゼ基質溶液の膜をインキュベートします。基質溶液中の色素は、膜の抗体抗抗タンパク質に結合し、暗い色の帯域を形成します。このプロセスは、バンドが観察される前に即時または必要な場合があります。
- 12
膜を完全にセロハンで包み、ゲル象牙の上に直接置き、結果を視覚化します。 Gel-Imagerは、ウエスタンブロット膜に表示された結果を撮影できます。
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