共免疫沈降（Co‑IP）プロトコル
共免疫沈降（Co‑IP）概要
Co‑IPは、タンパク質間相互作用を解析するために広く用いられる手法です。まず、目的タンパク質に特異的な抗体を細胞抽出液に添加し、抗体‑タンパク質複合体を形成させます。次に、Protein AまたはProtein Gを結合したシフェアロースビーズで複合体を捕捉し、洗浄します。最後に、精製したタンパク質バンドをシークエンス解析またはウェスタンブロットで同定します。
一般的な手順
手順は大きく3つに分かれます。
- 作業工程：実験を最短時間で完了させるための流れ。
- 実験上の留意点：バッファー選択やビーズの種類など。
- トラブルシューティング：問題が起きた際の対処法。
具体的な手順
1. 培養細胞の準備と抽出液の作成
2. 抗体添加とインキュベーション
3. Protein A/Gビーズでの免疫沈降
4. 洗浄とエリュート
5. 目的タンパク質の検出（ウェスタンブロットまたは質量分析）
留意点
- 抽出前のプレクリーニング（細胞破砕や遠心）
- バッファーのpHと塩濃度の最適化
- Protein AとProtein Gのどちらを使用するかは抗体の種に依存
トラブルシューティング例
- タンパク質が検出できない → 抗体濃度やインキュベーション時間を見直す
- 抗体がタンパク質に結合しない → 抗体の保存状態やフラグメント化を確認
- 非特異的結合が多い → ビーズのブロッキングや洗浄条件を強化