NADHを検出する方法

「NAD」と略されたニコチンアミドアデニンジヌセルトイド（NADH）は、タンパク質に化学反応を生成する生細胞に見られる補酵素です。製薬会社は、その代謝プロセスのためにNADHを研究し、多くの目的のために合成的にそれを作成します。 Nadhは顕微鏡であるため、肉眼ではそれを見つけることができません。その存在を検出するには、科学テストとアッセイキットが必要です。

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必要なもの

• ドライアイス
• micro-centrifuge
• eppendorfチューブ

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手順

1. 試薬再構成

   • 1

     サイクリングバッファーをカウンターに設定し、バッファーが室温に達するようにします。バッファーの理想的な温度は摂氏22度です。

   • 2

     NADサイクリング酵素ミックスを、正確に220マイクロリットルのサイクリングバッファーと再構成します。摂氏-70度下の温度で溶液を凍結します。

   • 3

     1.2 mLのDDH2OでNADH開発者を再構成します。溶液が完全に溶解するまで静かに混ぜます。 Vortex。

   • 4

     200マイクロリットルの純粋なジメチルスルホキシドでNADH標準を再構成します。

   サンプルの準備

   • 5

     リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。

   • 6

     個々のアッセイのペレット2x10（5）細胞は、マイクロ遠心管への細胞を5分間2,000 rpmで実行します。

   • 7

     2サイクルで細胞を凍結および解凍することにより、400マイクロリットルのNAD/NADH抽出バッファーで細胞を抽出します - ドライアイスで20分、室温で10分間。渦抽出細胞を正確に10秒間渦。

   • 8

     14,000 rpmのマイクロ染色で細胞サンプルをちょうど5分間スピンします。

   • 9

     NAD/NADHセルをきれいなチューブに移します。

   アッセイプロトコル

   • 10

     990マイクロリットルNAD/NADH抽出バッファーを備えたNADH標準の10マイクロリットルを希釈します。 0、2、4、6、8、10希釈溶液の10マイクロリットルを96ウェルプレートに重複して追加して、0、20、40、60 80、100標準を作成します。 NAD/NADH抽出バッファーの50マイクロリットルで最後の井戸を埋めます。

   • 11

     抽出された細胞サンプルの50マイクロリットルを以前のように複製して96ウェルプレートに移します。

   • 12

     NADH検出のために細胞サンプルを準備します。抽出された細胞サンプルの200マイクロリットルをEppendorfチューブに入れて、細胞サンプルからNADを分解します。温度制御された水浴で、チューブを摂氏60度までちょうど30分間加熱します。チューブを氷の上に置いて、サンプルをすばやく冷却します。マイクロ頻度のサンプルを回転させて、沈殿物を除去します。分解されたサンプルの50マイクロリットルを以前と同じように重複して96ウェルプレートに移します。

   • 13

     NADサイクリングバッファーミックスを100マイクロリットルのNADサイクリングバッファーミックスと2マイクロリットルのNADサイクリング酵素と混合します。この新しいソリューションの100マイクロリットルをNADHの標準とサンプルの各井戸に追加します。

   • 14

     室温でプレートをちょうど5分間インキュベートします。このプロセスは、NADをNADHに変換します。

   • 15

     NADH開発者の10マイクロリットルをすべての井戸に追加します。プレートを室温で最低1時間、最大4時間にしてください。

   • 16

     プレートを読み、nadhを計算します。