NADHの検出方法

NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）＋Hは、細胞内で酵素反応を助ける重要な補酵素です。製薬会社はその代謝経路を研究し、様々な目的で合成しています。NADHは分子レベルで存在するため肉眼では確認できず、専用のアッセイキットと測定手順が必要です。

必要なもの

• ドライアイス
• マイクロ遠心機
• Eppendorfチューブ

手順

試薬の再構成

1. サイクリングバッファーをカウンター上に置き、室温（22℃）になるまで待ちます。

2. NADサイクリング酵素ミックスに正確に220 µLのサイクリングバッファーを加えて再構成し、-70℃以下で凍結保存します。

3. NADHデベロッパーを1.2 mLのddH₂Oで再構成し、優しく混合して完全に溶解させます（渦巻き混合は避ける）。

4. NADH標準液を200 µLの純粋なジメチルスルホキシドで再構成します。

サンプル調製

5. 細胞をPBSで洗浄します。

6. 各アッセイごとに2×10⁵個の細胞をマイクロ遠心チューブに入れ、2,000 rpmで5分間遠心します。

7. 細胞を400 µLのNAD/NADH抽出バッファーで抽出し、ドライアイス上で20分、室温で10分の凍結・解凍サイクルを2回行い、10秒間軽く渦巻き混合します。

8. 抽出液を14,000 rpmで5分間遠心し、上清を清浄なチューブへ移します。

アッセイプロトコル

10. NADH標準液10 µLを990 µLの抽出バッファーで希釈し、0、2、4、6、8、10 µL（それぞれ0、20、40、60、80、100 µL相当）を96ウェルプレートに複製で分注します。最後のウェルは抽出バッファー50 µLで満たします。

11. 抽出した細胞サンプル50 µLを同様に96ウェルプレートに複製で分注します。

12. 細胞中のNADを分解するため、抽出サンプル200 µLをEppendorfチューブに入れ、60℃の水浴で30分加熱し、すぐに氷上で冷却します。その後遠心し沈殿を除去し、分解サンプル50 µLを再度プレートに複製で分注します。

13. サイクリングバッファー100 µLと酵素2 µLを混合し、各ウェル（標準液とサンプル）に100 µLずつ加えます。

14. プレートを室温で5分間インキュベートし、NADをNADHへ変換させます。

15. 各ウェルにNADHデベロッパー10 µLを加え、室温で最低1時間、最大4時間放置します。

16. プレートリーダーで吸光度を測定し、標準曲線からNADH濃度を算出します。