細胞表面ビオチン化プロトコル

ビオチン化は、可溶性ビタミンビオチンの能力を使用して細胞タンパク質に結合します。ビオチンはタンパク質連鎖球菌に結合するため、細胞生物学では細胞タンパク質を視覚化するのに役立ちます。ビオチン化は、放射能などの技術と比較してタンパク質の安全な標識を可能にし、細胞の正常機能に影響しません。これにより、研究者は受容体などの細胞タンパク質を研究することができ、疾患や疾患のプロセスをより深く理解することができます。

1. 懸濁細胞の標識

   • 汚染物質を除去するために、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の細胞を洗浄します。トリスとグリシンを含む緩衝液はビオチン化と競合し、避ける必要があります。ビオチン化内部タンパク質を避けるために、標識は摂氏4度またはアジドの存在下で行うことができます。 PBSおよび可溶性ビオチン、スルホ-NHS-LC-ビオチンの細胞を再懸濁します。

   接着細胞の標識

   • PBSで細胞を洗浄し、スルホ-NHS-LC-ビオチンなどの生成物とインキュベートします。次に、細胞を皿に削り、洗剤Triton-X100を含む緩衝液に溶け、視覚化のために準備しました。

   標識細胞の準備

   • インキュベーション後、細胞をペレットに遠心分離し、PBSで洗浄します。細胞はPBSに再懸濁され、IgGセファロースゲルで精製されます。結合されたタンパク質は、荷重バッファーで希釈され、摂氏100度まで加熱されます。

   細胞の視覚化

   • 希釈タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を使用して視覚化できます。その後、タンパク質および酵素混合、ストレプトアビジンホルセラディッシュ過酸化物による吸い上げができます。ブロットは、化学発光---光を放出する化学反応で視覚化されます。ビオチン化の特異性は、研究中のタンパク質の抗体で確認できます。