細胞表面のビオチン化プロトコル

概要

ビオチン化は、可溶性ビタミンであるビオチンが細胞タンパク質に結合する性質を利用した手法です。ビオチンはストレプトアビジンと強く結合するため、細胞生物学においてタンパク質の可視化に広く用いられます。放射性標識などに比べ安全で、細胞の通常機能を阻害しません。受容体などの細胞表面タンパク質の研究や、疾患メカニズムの解明に有用です。

懸濁細胞の標識

• 氷冷のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、汚染物質を除去します。Trisやグリシンを含むバッファーはビオチン化と競合するため使用しないでください。

• 内部タンパク質のビオチン化を防ぐため、4℃で、またはアジド存在下で処理します。

• 細胞をPBSと可溶性ビオチン（Sulfo‑NHS‑LC‑Biotin）に再懸濁し、適切な時間反応させます。

接着細胞の標識

• PBSで細胞を洗浄し、Sulfo‑NHS‑LC‑Biotinでインキュベートします。

• 処理後、細胞を培養皿からスクレイプし、Triton‑X100 を含むバッファーで破砕します。これによりタンパク質抽出液が得られ、後続の可視化に備えます。

標識細胞の調製

• インキュベーション後、遠心分離で細胞をペレット化し、PBSで洗浄します。

• ペレットをPBSに再懸濁し、IgG Sepharose ゲルでビオチン化タンパク質を精製します。

• 得られたタンパク質をロードバッファーに希釈し、100℃で加熱して変性させます。

細胞タンパク質の可視化

• 変性したタンパク質を SDS‑PAGE で分離し、ストレプトアビジン‑HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と混合したブロッティングで検出します。

• 化学発光反応により光が放出され、バンドが可視化されます。ビオチン化の特異性は、対象タンパク質に対する抗体で確認できます。