細胞の生存率を測定する手順
細胞培養実験では、サンプル中の生存細胞と死滅細胞を区別することが重要です。染色除外法は、細胞膜が完整な生細胞は染料を取り込まず、膜が破れた死細胞は染料が細胞質に浸透するという原理に基づき、最も広く用いられています。コストや感度、手順の簡便さを考慮し、ここではトリパンブルー染色法を例に、5〜10分で測定できる手順を紹介します。
必要なもの
- 0.4% トリパンブルー試薬
- 血球計数板（ヘマサイトメーター）
- カバーガラス
- マイクロピペット
- ピペットチップ
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
- 光学顕微鏡
手順
- 測定対象の細胞を遠心分離し、ペレットを得る。
- PBSでペレットを再懸濁し、濃度を約5×10⁵細胞/ｍLに調整する。血清は染色に影響を与えるため、使用しない。
- 細胞懸濁液と0.4%トリパンブルー染料を等量（例：100µLずつ）混合し、1:2の希釈液を作る。ピペッティングでよく混ぜる。
- 室温で 3分未満（できるだけ短く）インキュベートする。5分以上放置すると細胞死が進み、結果が不正確になる。
- カバーガラスを血球計数板にセットし、各チャンバーに 10〜20µL の染色液を注ぐ。
- 光学顕微鏡のステージに血球計数板を置き、細胞に焦点を合わせて観察する。
- 計数板のいずれかの正方形を選び、総細胞数、青く染まった非生存細胞数、透明な生存細胞数をそれぞれ数える。
- 生存率は、（生存細胞数 ÷ 総細胞数）×100 で算出する。複数の正方形で測定し、平均値を取ると精度が向上する。