ELISAアッセイの実行方法
タンパク質ベースのELISAアッセイでは、「捕捉」抗体またはタンパク質がアッセイ皿に敷設され、皿に付着するようになり、その後、「プローブ」剤（目的のタンパク質など）が敷設され、捕獲剤とインキュベートされます。 数回の洗浄の後、抗体抗原またはタンパク質間結合の有無を視覚化するために、「検出」抗体が追加されます。
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必要なもの
- アッセイ皿（たとえば、96-well block）
- キャプチャ抗体（50 mm nahco2、ph 9.6で5 ug/mlに希釈）
- プローブ抗体/タンパク質（さまざまな濃度に希釈）
- 検出抗体（たとえば、西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体）
- ptバッファー（1x pbs、0.05％Tween-20）
- ブロッキングバッファー（5 mg/ml BSAを備えた1x PBS、または1x PBSの5％のスキムミルク）
- 検出試薬（つまり、TMB試薬混合物）
- 機械的ラボシェーカー
- コールドルームまたは冷蔵庫
- pipetter and tips
手順
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50 mM NAHCO2（pH 9.6）で5 ug/mlに抗体を希釈します。 テストに使用されるサンプルディッシュの各ウェルに50 ULを追加します。 プラスチックまたはアルミニウムで覆い、シェーカーの4度Cで一晩インキュベートします。
- 2
キャプチャ抗体を捨て、200 UL PTバッファーで2回洗浄します。 ウェルあたり200 ULのブロッキングバッファー（PBまたは5％のスキムミルク）を追加します。 4度で揺れながら2時間から一晩incubをc。
- 3
ブロッキングバッファーを投げ出し、200 UL PTバッファーで4回洗浄します。 PBまたは5％のスキムミルクのさまざまな濃度で「プローブ」タンパク質サンプルを追加し、100 ULをウェルあたり100 ULします。 4度で1時間の揺れをインキュベートします。プローブ溶液を投げ出し、200 UL PTバッファーで6回洗浄します。
- 4
追加検出抗体（HRP結合抗体）は、PBバッファーまたは5％のスキムミルク（0.05％Tween-20を含むもののいずれか）で1：4000を希釈し、サンプルあたり50 ULをウェルに加えました。 4度で揺れて30分から1時間c。
- 5
検出抗体溶液をダンプアウトし、ウェルあたり200 UL PTバッファーで6回洗浄し、続いて200 ULの1X PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で2回洗浄します。 PBSを捨てて、ウェルごとに100 ULの検出試薬を追加します（HRPの場合、TMB基質と過酸化物を1：1で混合して、新たに混合したTMB試薬を使用します）。
TMBとHRPを使用する場合：最後に、TBM反応を消すために、100個のUL 1M H3PO4（リン酸）をウェルごとに追加します。
96ウェルプレートリーダーなどのサンプル分析リーダーを使用してプレートを読み取ります。 （HRPおよびTMBの場合、ほとんどの読者に利用可能な「ELISAエンドポイントアッセイ」テンプレートを使用します。）
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