ELISAアッセイの実施手順
ELISA（酵素免疫測定法）は、試料中の抗原（例：タンパク質）や抗体を検出するための生化学的実験手法です。抗体と抗原の結合を利用し、細胞や分子間相互作用の評価にも応用できます。
必要なもの
- アッセイプレート（例：96ウェルプレート）
- キャプチャ抗体（50 mM NaHCO₃、pH 9.6で5 µg/mLに希釈）
- プローブ抗体／タンパク質（濃度は目的に応じて）
- 検出抗体（例：HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）結合抗体）
- PTバッファー（1×PBS、0.05 % Tween‑20）
- ブロッキングバッファー（1×PBSに5 mg/mL BSA、または1×PBSに5 % 脱脂乳）
- 検出試薬（例：TMB試薬）
- 機械式シェーカー
- 冷蔵庫または冷凍庫（4 °C）
- ピペットとチップ
手順
- キャプチャ抗体を5 µg/mL（50 mM NaHCO₃、pH 9.6）に希釈し、各ウェルに50 µLを添加。プラスチックまたはアルミホイルで覆い、シェーカー上で4 °Cで一晩インキュベート。
- キャプチャ抗体を除去し、200 µLのPTバッファーで2回洗浄。各ウェルに200 µLのブロッキングバッファー（PBSまたは5 % 脱脂乳）を加え、4 °Cで2時間〜一晩シェーカーでインキュベート。
- ブロッキングバッファーを除去し、200 µLのPTバッファーで4回洗浄。プローブタンパク質（濃度は各自設定）を100 µLずつ各ウェルに添加し、4 °Cで1時間シェーカーでインキュベート。その後、プローブ溶液を除去し、200 µLのPTバッファーで6回洗浄。
- 検出抗体（HRP結合抗体）をPBバッファーまたは5 % 脱脂乳に1:4000に希釈し、各ウェルに50 µLを添加。4 °Cで30分〜1時間シェーカーでインキュベート。
- 検出抗体を除去し、200 µLのPTバッファーで6回洗浄。その後、1×PBSで2回洗浄。各ウェルに100 µLの検出試薬（HRP用はTMB基質と過酸化水素を1:1で混合）を添加し、室温で15分間時々シェーカーしながら反応させる。
TMB反応を停止するため、各ウェルに100 µLの1 M H₃PO₄を加える。
プレートリーダー（例：96ウェルプレートリーダー）で測定。HRP/TMBの場合は「ELISA End‑Point Assay」モードを使用。