プラークアッセイの手順と原理

概要

アッセイはウイルスを分離・精製し、ウイルス濃度（感染を引き起こす最小濃度）を測定する手法です。プラークアッセイは、もともとバクテリオファージの感染力を測定するために開発され、後に哺乳類ウイルスのカウントにも応用されています。

プラークとは

プラークは、単一のウイルス粒子が細胞単層培養に感染し、ウイルスが増殖して細胞を死滅させた結果生じる、円形の死滅領域です。感染した細胞から新たに産生されたウイルスは隣接する細胞へと広がり、同様に死滅させてプラークが拡大します。

機能

プラークアッセイでは、培養液を特定の染料で染色し、生存細胞だけが色付くようにします。死滅した細胞は染色されないため、背景が染料で染まった中に無色のプラークがはっきりと見えます。現在は、赤血球を溶血させる抗体を産生する細胞の検出にも応用されています。

特徴

赤血球はヘモグロビンを含み、酸素と二酸化炭素の輸送を担う血液細胞です。溶血は赤血球が破裂してヘモグロビンが放出される現象で、プラークアッセイでは抗体による赤血球の溶血が起こると、染料で染まらない明瞭なプラークが観察されます。

手順（パート I）

ウイルス株を10倍希釈し、0.1 mL を細胞単層に添加します。ウイルスが細胞に感染する時間を確保した後、培地（通常はアガーを含む）で覆います。培地はゲル化し、感染細胞から放出されたウイルスは周囲の細胞への拡散が制限され、円形のプラークが形成されます。培養後、プラークは肉眼で確認できるサイズに成長し、染色により視認性が向上します。

手順（パート II）

プラーク数は「プラーク形成単位（PFU）/mL」として算出します。測定誤差を減らすため、10〜100個のプラークが得られたプレートのみを使用します。100個のプラークをカウントした場合、測定値の誤差は±10 %程度とされ、適切に実施すればプラークアッセイの推定誤差は約10 %です。