凍結保存手順

凍結保存手順とは、極限の寒い温度を使用して代謝活動を停止することにより、細胞を無期限に保存できるようにするものです。凍結保存手順には、平衡（従来の遅い凍結）と非平衡または超濃度の凍結（硝化）の2つの主要なタイプがあります。ガラス化という用語は、ラテン語の「硝子体」またはガラスのようなものです。どちらの手順でも、凍結プロセス中の細胞損傷を防ぐために、不凍液タイプの特性を備えた凍結防止剤を使用します。細胞を凍結またはガラス化すると、液体窒素に浸すことにより、細胞を無期限に保存できます。解凍時に細胞内の代謝活性を回復するには、細胞から毒性凍結保護剤を除去する必要があり、細胞が通常の機能温度に戻されると通常の水バランスが徐々に回復する必要があります。

1. 概要

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   概要

   • 凍結保存手順とは、極限の寒い温度を使用して代謝活動を停止することにより、細胞を無期限に保存できるようにするものです。凍結保存手順には、平衡（従来の遅い凍結）と非平衡または超濃度の凍結（硝化）の2つの主要なタイプがあります。ガラス化という用語は、ラテン語の「硝子体」またはガラスのようなものです。どちらの手順でも、凍結プロセス中の細胞損傷を防ぐために、不凍液タイプの特性を備えた凍結防止剤を使用します。細胞を凍結またはガラス化すると、液体窒素に浸すことにより、細胞を無期限に保存できます。解凍時に細胞内の代謝活性を回復するには、細胞から毒性凍結保護剤を除去する必要があり、細胞が通常の機能温度に戻されると通常の水バランスが徐々に回復する必要があります。

   細胞特異的因子

   • 細胞または組織を凍結するために使用される手順は、細胞のサイズ、細胞液の量（細胞質）、細胞の複雑さ（単一細胞または組織）などの多くの因子に依存します。 卵などの大量の細胞質を持つ細胞は、精子細胞のような残留細胞質のみを持つ細胞よりも凍結するのが困難です。卵巣組織の凍結保存は、少なくとも3つの異なる細胞タイプのさまざまなサイズが卵巣組織に存在し、それぞれが最適な凍結ニーズが異なるため、より困難です。遅い凍結プロトコルは、さまざまな種類のセルで成功して使用されています。現在、ガラス化は単一細胞の凍結で最も効果的であり、組織では効果が低下していますが、組織のガラス化を最適化するための研究は継続的です。

   凍結防止剤の役割

   • 細胞の細胞質には水が含まれており、凍結温度で氷の結晶に変わります。氷が細胞内に形成されると、細胞は細断されて死にます。したがって、細胞の損傷を避けるために、凍結温度に到達する前に、細胞内の液体を除去する必要があります。グリセロール、プロパンディオール、ジメチルスルホックス（DMSO）、エタノール、スクロースやトレハロースなどの糖を含む、凍結前に細胞を脱水するために、さまざまな種類の不凍液（凍結防止剤）液を使用できます。冷却（および解凍）の最適な速度は、使用される凍結防止剤のタイプと、凍結する（またはそれがあった）細胞または組織の特性に依存します。凍結防止剤は細胞を代謝するために毒性があるため、暖かい代謝温度での凍結防止剤への細胞曝露は最小化または回避する必要があります。細胞を解凍または温暖化すると、代謝活性が回復する前に、細胞から凍結防止剤を完全に除去する必要があります。

   平衡対非平衡凍結保存手順

   • 凍結の速度は、凍結プロトコルが平衡ベースか非平衡ベースであるかに依存します。平衡型手順の場合、細胞が水を脱水している速度と、細胞外の水が氷期に変換される速度との間にバランスがある場合、最適な凍結速度が達成されます。これらの平衡プロトコルまたはゆっくりとしたフリーズプロトコルは通常、完了するのに数時間かかり、コンピューターを使用してプログラム可能なレートフリーザーを実行して、凍結速度が正確に必要に応じていることを確認します。通常、スタート近くのプロトコルには、セルの外側の液体にスターターアイスクリスタルまたは「シード」を手動で作成できるようにするために、プロトコルに「保留」ステップがあります。

     抑制では、ランプに依存せず、脱水と氷の結晶形成の間の平衡を達成することのない凍結に対するまったく異なるアプローチが使用されます。ガラス化は非常に非常に激しいため、氷の形成には時間が不十分であり、細胞液は細胞に損傷を与えることなく、硝子体またはガラス相に直接変換されます。細胞が非常に冷たい液体窒素に直接急落し、瞬時のガラス状態を達成するため、プログラム可能な速度冷凍庫は必要ありません。

   低凍結手順

   • ゆっくりしたフリーズ手順の最初のステップは、細胞を徐々に段階的に凍結防止剤にさらして、水を放出しながら凍結防止剤との細胞の平衡化をゆっくりと可能にすることです。細胞が大部分の細胞水から除去されると、凍結保護液の細胞は、プラスチックストロー、ガラスのアンプル、またはプラスチックバイアルなど、ある種の容器に入れられます。ゆっくり凍結するための細胞を囲む液体の体積は、ティースプーンよりも少なくなり、数滴しかありません。事前に隠れた容器は満たされ、密閉され、プログラム可能な冷凍庫に入れられ、数分または数時間にわたって非常に低い温度まで容器の温度がゆっくりと低下します。数分の冷却の後、容器を「シード」することにより、容器内にスターターアイスクリスタルを形成する必要があります。播種は、液体窒素で事前に冷却されて容器に触れて氷の結晶形成を引き起こすツール（たとえば、鉗子）を使用して実行されます。このスタータークリスタルは、細胞から安全に離れた1つの場所で制御された氷の結晶の形成を開始します。 播種が完了すると、残りの冷却ランプが進むことができます。容器が-30〜 -85 cの温度に達すると、細胞を保持する容器を液体窒素に直接突っ込んで-196 c。

     までの冷却を完了することができます。

   ガラス化

   • 硝酸化などの超微量非平衡冷却手順は、細胞を直接液体窒素に直接押し込むことによって達成されるほぼ瞬時の凍結速度と相まって、より高い濃度の凍結保護剤を使用します。ガラス化は、氷結晶の形成相をバイパスし、水をガラスのような位相に直接動かします。ガラス化は、遅い凍結と同じエンドポイントを達成しますが、10c/min以上と比較して-3000c/minの速度で達成されます。ガラス化のために、細胞は通常、わらの先端に置かれ、過剰な凍結防止剤が除去され、液体窒素に突入する前に、細胞が表面張力によって容器にしがみつくように十分に残します。 凍結は非常に迅速であるため、凍結防止剤への曝露の期間ははるかに少なく、細胞によって凍結防止剤の濃度がはるかに高くなります。細胞を温めるためにそれを通常の代謝機能に戻すことも非常に迅速でなければなりません。液体窒素の温度に短時間の曝露でさえ、予定外の温暖化プロセスを開始し、細胞に有害であるため、ビトリファイドサンプルの取り扱いはゆっくりと凍結したサンプルよりもはるかに厳密です。