凍結保存手順の概要と実施方法

概要

凍結保存（クライオ保存）とは、極低温で代謝活動を停止させ、細胞を無期限に保存できる技術です。主に「平衡凍結（従来の緩慢凍結）」と「非平衡凍結（急速凍結・ガラス化、ビトリフィケーション）」の2種類があります。ビトリフィケーションはラテン語の "vitreous"（ガラス状）に由来し、凍結過程で氷結晶が形成されないよう、凍結保護剤（クリオプロテクタント）を用います。凍結またはビトリフィケーションされた細胞は、-196℃（-321°F）の液体窒素中で長期間保存できます。解凍時には、毒性のある凍結保護剤を除去し、細胞の水分バランスを徐々に戻しながら、正常温度へ戻す必要があります。

細胞別の考慮点

凍結保存の手法は、細胞サイズ、細胞質量、単一細胞か組織かといった要因で選択が変わります。卵子のように細胞質が多い細胞は、精子のように細胞質が少ない細胞に比べて凍結が難しいです。卵巣組織は、サイズや凍結条件が異なる3種以上の細胞が混在しているため、特に高度な技術が必要です。従来の緩慢凍結は多くの細胞で成功していますが、ビトリフィケーションは現在、単一細胞の凍結に最も適しており、組織への応用は研究が進められています。

凍結保護剤の役割

細胞内の水分は凍結温度で氷結晶となり、細胞を破壊します。そのため、凍結前に細胞内の水分を除去し、氷結晶の形成を防ぐ必要があります。グリセロール、プロパノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エタノール、スクロースやトレハロースといった糖類が主な凍結保護剤です。凍結速度と解凍速度は使用する凍結保護剤と細胞・組織の特性に依存します。凍結保護剤は代謝中の細胞に対して毒性があるため、温かい状態での接触時間は最小限に抑える必要があります。解凍時は、細胞が正常に代謝を再開できるよう、凍結保護剤を完全に除去します。

平衡凍結と非平衡凍結の違い

平衡凍結（緩慢凍結）では、細胞の脱水速度と外部の水が氷になる速度がバランスするように凍結速度を調整します。通常、数時間かけてプログラマブルフリーザーで温度を徐々に下げ、開始段階で「シーディング」と呼ばれる氷結晶の種を作ります。

ビトリフィケーションは、凍結速度を極めて速く（約-3000℃/分）し、氷結晶が形成される時間すら与えません。細胞は液体窒素に直接浸すだけで、瞬時にガラス相（ビス）へと変化します。プログラマブルフリーザーは不要です。

緩慢凍結手順

1. 細胞を段階的に凍結保護剤に曝露し、徐々に脱水させながら平衡状態に持っていく。
2. 細胞をプラスチックストロー、ガラスアンプル、またはプラスチックバイアルなどに移し、数滴程度の凍結保護液を入れる。
3. ラベルを貼ってプログラマブルフリーザーに入れ、数分〜数時間かけて温度を-30〜-85℃まで下げる。
4. 液体窒素で冷却したツールでシーディングを行い、氷結晶の種を作る。
5. その後、-196℃の液体窒素に直接投入し、保存温度に到達させる。

ビトリフィケーション手順

1. 高濃度の凍結保護剤を用いて、細胞を極短時間だけ曝露する。
2. ストロー先端に細胞を乗せ、余分な凍結保護剤を除去し、表面張力で細胞を保持させる。
3. 直ちに液体窒素に浸し、-3000℃/分という超高速で凍結させる。
4. 解凍も同様に急速に行い、凍結保護剤を速やかに除去して代謝活性を回復させる。

ビトリフィケーションは、凍結保護剤への曝露時間が極めて短く、濃度が高くても細胞が耐えられる点が利点です。一方、取り扱いは繊細で、液体窒素上の短時間でも温度上昇が起こると細胞が損傷するため、注意が必要です。