FRETアッセイの実施手順

蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）は、2つのレポーター結合タンパク質間の結合有無と結合量を測定するアッセイ手法です。細胞内の相互作用解析や、コンジュゲーション型酵素の活性評価などに広く利用されます。使用する検出装置は、レポーター分子の種類に依存しますが、多くの場合は 96 ウェルプレートリーダーで十分です。

必要なもの

• 目的タンパク質／レポーター分子の構築体（各タンパク質ごと）
• 96 ウェルプレート用ブロック
• 96 ウェルプレートリーダー
• 反応バッファー（一般的には Tris またはリン酸緩衝食塩水）
• 結合酵素（必要な場合）

手順

1. セットアップと測定

   • 各目的タンパク質を GFP、ローダミン、BODIPY などの蛍光分子と融合させた構築体を作製または用意する。
   • 各蛍光分子の吸収波長と発光波長、ならびにアッセイ全体の励起・検出波長を決定する（例：GFP→ローダミンの場合、励起 488 nm、検出 595 nm）。
   • 目的タンパク質の性質に合わせた反応バッファーを調整する。一般的には CaCl₂ と 0.05 % Tween‑20 を含む Tris バッファーが用いられる。文献で同様条件の報告を参照すると濃度が分かる。
   • レポーター結合タンパク質を様々な濃度で混合し、50–200 µL を各ウェルに分注する。必要に応じて結合酵素（例：ソルターゼ）を加える。エンドポイント測定の場合は室温（または酵素最適温度）でインキュベート後、リーダーで測定する。キネティック測定の場合は直ちにリーダーで測定を開始する。
   • プレートを 96 ウェルリーダーにセットし、実験設定画面で励起波長と蛍光検出波長を入力し、測定対象ウェルを選択する。キネティック測定では測定間隔（例：10 分ごと）と測定時間を設定する。測定開始後、得られたデータは Excel や GraphPad Prism などでグラフ化し解析する。