FRETアッセイの実施方法

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、2つのレポーター結合タンパク質間の結合の存在と量を測定するために使用されるアッセイ技術です。 このアッセイは、一般に、さまざまな種類の細胞の潜在的に結合するタンパク質を分析し、共役型酵素の有効性を測定するために使用されます。必要な検出装置は、使用されているレポーター分子の種類に大きく依存しますが、多くの場合、単純な96ウェルプレートリーダーを使用できます。

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必要なもの

• テストされている各タンパク質のタンパク質/レポーター分子コンストラクト
• 96-wellプレートブロック
• 96-wellプレートリーダー
• 反応バッファー（一般にトリス酸緩衝液ベースまたはリン酸緩衝塩ベース）
• コンジュゲーション酵素（必要に応じて）

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手順

1. セットアップと読み取り

   • 1

     関心のある各タンパク質の融合構築物を生成または調製し、それぞれが緑色蛍光タンパク質（GFP）、ローダミンまたはホウ素 - ジピルロメテン（Bodipy）などの蛍光交換分子にリンクされています。

   • 2

     各蛍光成分と全体的なアッセイの吸光度と放射波長を決定します。 （たとえば、アッセイがGFP->ローダミン蛍光エネルギー伝達を測定する場合、入力吸光度波長はGFPの吸光度（488 nm）のものであり、発光検出波長はローダミン（595 nm）のものです）。

   • 3

     目的の生化学的特性のタンパク質に応じて、実験に適した反応バッファーを作成します。 塩化カルシウムと0.05％Tween-20を含むTRISベースの緩衝液がよく使用されます。 特定の濃度とコンポーネントは、同様の反応と条件を詳述するジャーナルエントリを検索することで決定できます。

   • 4

     反応緩衝液のさまざまな濃度で対象の2つのレポーター結合タンパク質を混ぜ、井戸あたり50-200 ULをアリコートします。 必要に応じて、各サンプルにコンジュゲーション酵素（たとえば、ソートゼなど）を追加します。 エンドポイントアッセイを実行する場合は、室温（または酵素の最適温度）で断固たる期間にインキュベーションを許可し、96ウェルプレートリーダーで読み取ります。 速度論アッセイを実行する場合は、直接読み取りに進みます（以下を参照）。

   • 5

     サンプルプレートを96ウェルプレートリーダーに挿入します。 新しい実験ページを作成し、[設定]メニューにアクセスします。 正しい吸光度（励起）と放射波長を入力し、読み取る適切なウェルを選択します。

     運動学実験を実行する場合は、実験の時間コースと測定値間隔（10分ごとなど）を設定します。

     サンプルの読み取りを開始します。

     Microsoft Excelのグラフ機能（またはGraphPadなどの別のグラフプログラム）を使用してデータを分析します。