DNA電気泳動の手順：アガロースゲル作成から結果解析まで
概要
アガロースゲル電気泳動は、DNA断片をサイズ別に視覚的に分離・分析する最も一般的な方法です。DNAは負電荷を持つため、電場の正極へ移動します。小さな断片ほど速く、大きな断片は遅く移動します。エチジウムブロモイドで染色したゲルを紫外光下で観察し、サンプルを比較できます。
必要なもの
- 0.7%〜2%のアガロースゲル用アガロース粉末
- トリス‑ボレート‑EDTA（TBE）・トリス‑酢酸‑EDTA（TAE）・リチウム酢酸ナトリウム（LA）・ホウ酸（SB）バッファー
- エチジウムブロモイド
- ゲルローディング染料
- ゲルトレイ
- 電気泳動槽
- 手袋・保護メガネ
- ピペット（1 µL〜1 mL）
- 電気泳動用コム（ピンセット）
アガロースゲル（0.7%）の作成手順
- アガロース粉末 0.7 g を 250 mL の円錐形フラスコに入れる。
- 1× バッファー（TAE、TBE、SB、または LA）を 100 mL 加える。
- マイクロ波またはバンゼンバーナーで約1分加熱し、溶液が透明になるまで加熱する。
- フラスコを熱源から取り出し、55〜60 ℃まで冷ます。
- 冷却した溶液にエチジウムブロモイド 1 µL を加え、軽く撹拌する。
- 気泡が入らないよう注意しながら、ゲルトレイにゆっくりと注ぐ。ウェルダムが無い場合はマスキングテープで代用する。
- 電気泳動コムを慎重に挿入し、約25分間ゲルを固める。
- 作成したゲルを 1× バッファー（最大5 mL）で覆い、電気泳動槽にセットする。
DNAサンプルの準備とゲルへのロード
- PCR 産物や抽出DNAなど、5〜10 µL を新しいチューブに移す（全反応混合物を使用する場合はそのままで可）。
- 各チューブに 0.2× ローディングバッファーを加える。
- 電気泳動コムをゆっくり取り外し、ゲルが損傷しないよう注意する。
- DNAマーカー（5〜12 µL）を最初のウェルに加える。マーカーは目的とする断片サイズに応じて選択する。
- 残りのウェルにサンプル（5〜10 µL）をロードし、最後のウェルに同じマーカーを追加する。
- 電極を電気泳動槽に取り付け、電圧を 50〜150 V に設定する。
- 1〜4時間、ゲルを走らせる。
結果の解析
- ゲルを槽から取り出し、UVトランスイルミネーターで観察するか、ゲル撮影装置で画像を取得する。
- 各マーカー帯の移動距離を測定する。
- 測定距離と既知サイズを対数グラフ（半対数紙）にプロットし、最小二乗法でベストフィット線を描く。
- 未知帯の移動距離を測定し、ベストフィット線上に垂直に線を引いてサイズ軸と交点を求め、断片サイズを推定する。
以上の手順で、DNA断片のサイズを正確に評価できます。