免疫組織化学（IHC）での抗体希釈の作り方

概要

免疫組織化学（IHC）は、スライド上に固定した組織切片を、目的とするタンパク質に特異的な抗体で染色し、顕微鏡下で細胞や組織を可視化する手法です。抗体の希釈（滴定）は、各研究者が使用するプロトコルに合わせて行う必要があり、メーカーの推奨条件とは異なることがあります。

必要なもの

• 染色対象の細胞または組織切片
• 一次抗体
• 希釈バッファー（希釈液）
• ピペットとチップ
• マイクロ遠心チューブ
• アルミホイル
• ラベルシールやマーカー
• 氷
• 光遮断用スライドボックス

手順

1. 抗体を確認し、適切な宿主種・同一アイソフォームに対するものかをチェックする。ピペットで10 µLを取り、'personal stock' とラベル付けして別管に保管する。

   抗体量が極少量の場合はこのステップは省略できる。

   個別ストックは光から守るため、アルミホイルで包むか光遮断チューブに入れ、氷上（エスキー等）で保管する。濃度（例：100 U/mL、1 µg/µL など）と抗体名、希釈バッファー情報を管に記載する。

2. 希釈バッファー（抗体希釈液）を作成する。IHC の条件に合致し、蛍光や二次抗体の結合を妨げないことを確認する。一般的なブロッキングバッファーは、1×PBS に 1 % Triton‑X100、10 % 胎牛血清、0.2 % アジド酸ナトリウムを加えたもの。

3. 抗体を滴定する。個別ストックの濃度から、10 µg の抗体量に相当する体積を算出する。

   例として、2 µg 相当の抗体（X µL）を 100 µL の希釈液に加えて混合し、これを第1チューブとする。次に同じ X µL を別の 100 µL の希釈液に加えて第2チューブを作成する。これを 8〜10 回繰り返し、濃度勾配のあるシリーズを作る。

   最終チューブは最も低濃度で、実験で最大シグナルが得られる飽和濃度に相当する。ただし、実際に使用する濃度はやや高めに設定し、背景シグナルが過剰になるのを防ぐ。

   各チューブには新しい濃度を明記してラベル付けする。