IHCの抗体希釈を作る方法

免疫組織化学（IHC）は、科学者がスライドに置き、調査中の細胞または組織に固有のタンパク質を認識する適切な抗体で染色された組織内の細胞を視覚化するために使用する専門技術です。抗体希釈（滴定）は、2つが同一ではないため、抗体の製造業者のプロトコルではなく、ユーザー独自のプロトコルで指定された実験条件を使用して実行する必要があります。

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必要なもの

• 染色
• 抗体
• 希釈バッファー（ "diluent"）
• ピペットとヒント
• microfugeチューブ
• アルミホイル
• ラボマーカーとチューブラベル
• ice
• 軽く保護されたスライドボックス

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手順

1. • 1

     抗体を確認して準備します。抗体が正しい宿主で上昇しており、テスト中のタンパク質（アイソフォームまたはスプライスバリアントとして知られる）の正確なバージョンと反応していることを確認します。ピペットを使用して、これの10マイクロリットル部分を慎重に取り、「個人株」としてラベル付けします。

     非常に少量の抗体のみが利用可能な場合は、この手順をスキップしてください。

     抗体の個人在庫を維持することは、元の在庫の相互汚染を防ぐため、すべての研究所での日常的な実践です。これを軽く保護されたマイクロフージチューブ、または直接光から保護するためにアルミホイルに包まれた通常のマイクロフージチューブに分配します。

     このチューブを氷の上に置いてください。できれば気密性のある蓋のあるeskyで、抗体を破壊する可能性のある光を最小限に抑えます。元のストックの濃度（たとえば、ミリリットルあたり100単位、マイクロリットルあたり1ミリグラムなど）にメモをかけます。これには、抗体の名前や、緩衝液（血清、生理食塩水、または水など）で希釈するものを含みます。

   • 2

     抗体希釈液とも呼ばれる希釈バッファーを準備します。これが抗体と使用されている免疫組織化学的手順と互換性があることを確認してください。たとえば、蛍光を不明瞭にしたり、その後の二次抗体標識を阻害したりしないでください。 1xリン酸緩衝生理食塩水と1％Triton-X100、10％胎児の子牛血清、0.2％アジドナトリウムを混合することにより、標準的な免疫組織化学希釈（ブロッキングバッファー）を作成します。

   • 3

     抗体を滴定します。個人ストック内の抗体の濃度（マイクロリットルあたりのマイクログラムなどの濃度単位として表される）で、10マイクログラムの抗体を得るために必要な抗体の量を決定します。

     2マイクログラムの抗体（Xマイクロリットルなど）に相当するボリュームをピペットして、100マイクロリットルの希釈剤でピペットして、上下にピペッティングすることで完全に混合することにより、希釈シリーズを設定します。この開始希釈から、同じXマイクロリットルを採取し、それをその後の100マイクロリットルの希釈剤に追加します。これを繰り返して、8-10希釈（またはシリーズ）が構成されます。

     したがって、最後のチューブは濃度が最も低く、実験中に最高レベルの信号を生成する「飽和」濃度になります。ただし、理想的な濃度はこれよりもわずかに濃縮されるため、あまりにも多くの信号が生成されず、背景エラーを引き起こす可能性があります。

     新しい希釈濃度でチューブを正しくラベル付けします。