パラフィン埋め込み手順の概要

生体試料を顕微鏡観察用に切片化するには、まず試料を固形化して切断しやすくします。固形化により染色や抗体・プローブの浸透が容易になり、細胞層の重なりも軽減されます。パラフィンワックスは水と混ざらない硬い基質として広く用いられ、試料の脱水・固定・埋め込みの各工程で重要な役割を果たします。

Xylene（キシレン）処理

エタノールで脱水した試料は、キシレンでエタノールを除去します。その後、溶融したパラフィンワックスでキシレンを置換し、パラフィン埋め込みブロックを作製します。光学顕微鏡用の切片は通常5µmの厚さですが、より薄い切片にはパラフィンだけでは硬さが不足します。再水和が必要な場合は、まずキシレン、次にエタノール、最後に蒸留水で洗浄し、汚染を防ぎます。

固定（Fixing）

パラフィン埋め込み組織は、一般に中性緩衝ホルマリン（NBF）で固定します。NBF はホルムアルデヒドの商業用製剤で、パラホルムアルデヒドとメタノールが含まれ、ホルムアルデヒドが蟻酸に変換されるのを防ぎます。薄切り組織は室温で48時間固定すると顕微解剖学的観察に最適です。固定が不十分だと組織が硬く脆くなります。処理前は通常、4℃で保存した70％エタノールに保管します。

パラフィンプロセッサー

パラフィンプロセッサーは、試料を段階的に脱水しながら熱いパラフィンを浸透させる装置です。プロセッサーは夜間に稼働させ、組織の種類に応じて加熱時間を調整し、硬化や脆化を防ぎます。真空機能によりパラフィンの浸透が促進され、気泡が除去されます。処理後の組織はカセットに入れ、室温で保管します。

ワックスの溶解（Wax Melting）

パラフィンは使用前に1時間ほど溶かし、カセット全体を65℃のパラフィン浴に15分間浸します。その後、冷却用アルミニウムヒートシンクで20分間冷却し、固さを調整します。ワックスがひび割れたり、組織が正しく配置されていない場合は、再度溶解して同工程を繰り返します。

切片作製（Cutting）

組織ブロックを切断する際は、水浴を35〜37℃に保ち、蒸留・脱イオン水を使用します。ブロックは氷ブロックまたはヒートシンク上で10分間冷却し、刃で薄切りにします。切断時の主な問題はリボン化不良と標本の破砕です。破砕は水温が高すぎることが原因で、リボン化が不十分な場合は再度氷ブロックに戻してワックスを固め直します。