NBTアッセイのプロトコル

NBT（ニトロブルー四テトラゾリウム）は、生化学や免疫学でアルカリフォスファターゼ酵素を検出するために使用される化学化合物です。また、免疫防御細胞に影響を与える慢性肉芽腫症の診断にも利用されます。NBTアッセイのプロトコルには、免疫ブロッティング、BCIP/NBTアルカリフォスファターゼ基質溶液、組織中のガラクトシダーゼおよびアルカリフォスファターゼ活性の検出が含まれます。

免疫ブロッティング

免疫ブロッティングは、免疫防御に関与する抗体（タンパク質）を検出する手法です。Susan R. Haynes の『RNA-Protein Interaction Protocols』によれば、NBT に加えて、ウシ血清アルブミン、一次抗体（9E10）、コマッシー染色液、ニトロセルロース膜、Tris塩基緩衝液、硫酸アンモニウム、SDS、飽和ブタノールなどが使用されます。

BCIP/NBTアルカリフォスファターゼ基質溶液

BCIP/NBTアルカリフォスファターゼ基質溶液は、1% BCIP（5‑Bromo‑4‑chloro‑3‑indolyl phosphate）を3滴、1.5% NBT を3滴、レバミゾールを2滴、pH9.5 のアルカリフォスファターゼ緩衝液と混合して調製します（IHC World の手順）。調製後は室温でインキュベートし、使用可能な状態にします。

組織中のガラクトシダーゼ・アルカリフォスファターゼ活性の検出

ガラクトシダーゼは、ガラクトシド結合を切断できる酵素で、大腸菌（Escherichia coli）などに存在します。Protocol Online の手順では、PBS、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドで処理したラット細胞サンプルを用い、ブロモクロインドールガラクトピラノシド（X‑gal）反応バッファーを作製します。このバッファーには、シアン化カリウム、塩化マグネシウム、デオキシコレステロールナトリウム、界面活性剤 Nonidet P‑40 が含まれます。シアン化カリウムの代わりに NBT を使用すると、反応が速くなります。最終的に顕微鏡で観察します。