組換えプラスミドの増幅と伝播

概要

プラスミドは細菌や酵母の一部に存在し、染色体とは別に自己複製する小さな環状DNAです。遺伝子工学では、他種の遺伝子をプラスミドに組み込み、同種・異種の宿主細胞へ導入し、通常より高い速度で増幅させることが容易です。組換えプラスミドは他種からの遺伝子を含むプラスミドで、増幅により工業規模で目的タンパク質を迅速に大量生産できます。

必要なもの

• 既存のプラスミド・遺伝子ライブラリ、または自分で分離したプラスミドと遺伝子を組み合わせたもの
• 細胞培養用機器
• 増幅剤（例：塩化カルシウム、電気ショック、温度変化、クロラムフェニコール、Taq ポリメラーゼなど）

手順

1. プラスミドと宿主生物に最適な増幅方法を選択します。プラスミドや宿主種により適した方法は異なるため、試行錯誤が必要な場合があります。
2. トランスフォーメーションが可能な場合は、細胞とプラスミドを0℃の塩化カルシウム溶液で冷却し、続いて37〜43℃に急激に加熱します。この温度ショックで細胞膜がプラスミドを取り込みやすくなります。
3. 電気穿孔（エレクトロポレーション）を行う場合は、高電圧パルスをプラスミドと細胞の混合液に通します。これにより細胞膜の透過性が向上し、プラスミドが内部に導入されます。
4. 低濃度のクロラムフェニコールで培養液を処理し、1細胞あたり最大約100個のプラスミドを生成させます。この方法は宿主染色体の複製を抑制し、プラスミドの無制御増幅を促進します。
5. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてプラスミドを大量にコピーします。熱耐性酵素Taq ポリメラーゼを利用すれば、数十万倍以上の増幅が可能です。