制限酵素マップの作成方法
分子生物学の初期には、研究対象遺伝子の位置情報を得るために制限マッピングが頻繁に利用されました。現在はシークエンシングが主流となり、制限マッピングはあまり使われませんが、特定の条件下では依然として有用です。本稿では、制限酵素でDNAを切断し、ゲル電気泳動で断片を分離・測定することで、元のDNA配列上の酵素認識部位を推定する手順を紹介します。
必要なもの
- 制限酵素（例：EcoRI）
- 対象DNAサンプル
- 反応バッファー
- 氷と温度調整用のホットウォーターバス
- ゲル電気泳動装置および関連試薬
手順
1. DNAの切断
- DNAサンプルに制限酵素を加える。例として EcoRI（認識配列：GAATTC）を使用。
- 酵素とDNAの混合液を反応バッファーに入れ、反応容器を用意する。
- 酵素ごとに最適な温度（EcoRI は 37℃）に設定し、一定時間インキュベートする。インキュベーション前後は氷上で保冷し、酵素活性をコントロールする。
- 反応が終了したら、混合液をゲル電気泳動にかけ、サイズ別にDNA断片を分離する。小さな断片ほど遠くへ移動する。
- 電気泳動後、染色されたバンドの走行距離を測定する。この工程は使用する酵素ごとに繰り返す。
2. 制限マップの作成
- 各酵素で得られた断片長データを整理する。
- 酵素ごとの断片長を比較し、認識部位の相対的な位置関係を推定する。例えば、酵素Aが2つの等長断片、酵素Bが3つの等長断片を生成した場合、AはDNAの中点を、Bは1/3地点を切断したと考えられる。
- 推定した認識部位の順序を組み合わせ、DNA上の制限酵素サイトの配置図（制限マップ）を完成させる。