制限マップの作成方法

分子生物学の初期には、科学者は一般に制限マッピングを使用して、研究していた遺伝子を理解していました。 現代の研究室では、シーケンスが過去よりも広く利用可能で経済的になっているため、制限マッピングはほとんど時代遅れです。 ただし、研究者が調査を実行するのに適切な制限マップが適切である場合があります。 制限マッピングへの全体的なアプローチには、消化酵素を使用してDNAのサンプルを物理的に分解することが含まれます。 この消化の生成物を測定したら、ピースを「再組み立て」し、DNAの元のシーケンスを推定できます。

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必要なもの

• 制限酵素
• サンプルDNA
• バッファーソリューション
• 氷とお湯浴
• ゲル電気泳動装置

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手順

1. DNA消化

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     DNAサンプルに制限酵素を追加します。 たとえば、一般的に使用される酵素であるECOR1を使用します。

   • 2

     この混合物をバッファーソリューションに追加します。これは、基本的に反応が発生する場所です。

   • 3

     New England Biolabsマニュアルに示されているように、反応の温度を上げます。 各制限酵素は、それが最適に機能する特定の反応温度を持っています。 さらに、各酵素には、標的に設計された特定のヌクレオチド配列があります。 Ecoriは、ヌクレオチド配列CaattcでDNAをスキャンして切断します。 酵素がDNAを結合して切断するには、このヌクレオチドの正確な順序が存在する必要があります。この時点まで、不要な活動を防ぐためにすべての材料を氷の上に保持する必要があります。

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     マニュアルに示されているように反応が発生した後、ゲル電気泳動機で混合物を実行して、サイズに基づいてDNAフラグメントを分離します。 最小のフラグメントは、ジェル全体で最も遠い移動します。

   • 5

     各DNAフラグメントによって移動する距離を測定します。 これらの5つのステップは、複数の異なる酵素を個別に繰り返す必要があります。

   制限マップの構築

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     ゲルから取得したデータを使用して、さまざまな制限酵素を使用して見つけたすべての情報を収集します。

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     各酵素によって生成される異なるフラグメント長を比較することにより、制限部位の順序を推定します。 たとえば、酵素＃1が等しい長さの2つの断片を生成し、酵素＃2が等しい長さの3つの断片を生成した場合、酵素＃1はDNAの途中で切断し、酵素＃2がDNAを3分の1に切断すると結論付けることができます。

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     ステップ2で描かれた結論を使用して、DNAの制限部位の順序を組み立てます。