組織培養のコツ

組織培養とは

組織培養は、液体培地中で細胞を増殖させる実験手法で、遺伝性疾患の診断や細菌・ウイルスなどの細胞内病原体の培養、細胞そのものの研究に利用されます。

培養細胞の種類と取り扱い

培養皿の底に付着する細胞や、培地中に浮遊する細胞があります。細胞は植物由来・動物由来どちらでも、一次培養細胞（生体から直接採取）や、長期培養されている細胞株があります。細胞株はがん細胞であることが多く、実験計画や結果の解釈に注意が必要です。

細胞は優しく扱う

付着細胞を継代する際は、スクレイピングやプロテアーゼ（主にトリプシンとEDTA）で剥がします。スクレイピングは多くの細胞を死滅させるため、細胞抽出やトリプシン/EDTAを使えない場合に限ります。

トリプシン処理は、細胞と培養皿を結合させているタンパク質だけでなく、細胞膜上の多くのタンパク質も除去します。細胞は球状になり、再び皿に付着するまで通常は一晩かかります。トリプシンは最小量（25 cm²フラスコにつき約1 mL）を使用し、フラスコを5秒以内に軽く揺すってモノレイヤーをコーティングし、余分なトリプシンはすぐに除去します。処理中はインキュベーターで細胞を休ませましょう。

細胞が皿底から離れたら、血清入り培地を加えて、ピペットで優しく上下に吸引しながら懸濁させます。少量の培地は皿に残し、数回ピペットで混ぜて塊を崩し、均一な懸濁液を作ります。

ピペットに気泡を吸い込まないようにし、激しく混ぜたり渦巻き混合（vortex）したりしないでください。球状の状態の細胞は非常に脆弱です。

血清の熱処理は行うべきか

組織培養が始まった頃、胎児牛血清（FBS）には補体タンパク質が含まれ、これが細胞を溶解させることが分かっていました。補体活性は56 °Cで30分間加熱するか、37 °Cで事前に温めるだけで失活します。

当時は熱処理によりマイコプラズマなどの汚染物質も死滅していましたが、現在は0.1 µmや0.04 µmのフィルターでFBSや培地を滅菌するため、熱処理は必須ではなくなりました。

しかし、熱処理はビタミン、アミノ酸、増殖因子などの成分も劣化させ、増殖が遅い・扱いにくい細胞株では培養に支障を来すことがあります。

そのため、扱いにくい細胞株を培養する場合は、単にフィルター滅菌したFBSを使用するだけでも、細胞のロバスト性が向上することがあります。