3つのフラグメントライゲーションのトラブルシューティング方法
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必要なもの
- ligation kit
- ライゲーションプロトコル
- アガロースゲル
- 50 x TBAバッファー（242 g Trisベース、57.1 ml氷河酢酸、100 ml 0.5 m EDTA水で1リットルに希釈）
- 脱イオン水
- DNA精製キット
手順
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トラブルシューティング変換
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ライゲーションと変換に伴う手順のリストを策定します。科学的プロトコルのトラブルシューティングは、通常、最終的なステップから始まり、後方に作業します。
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サンプルからコントロールDNAまで精製されたDNA産物をキットに添えて比較します。 DNAが細菌で形質転換され、クローン化されると、アガロースゲル電気泳動により分離、精製、チェックすることができます。電気泳動の結果は、変換が成功したかどうかを示します。
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クローニング中の細菌の成長を決定します。ほとんどの細菌ベクターは構築されているため、DNA挿入物を持つもののみが、アンピシリンを含む培地または他の抗生物質で成長します。成長不良は、DNAサンプルがベクトルに正常に挿入されていないことを確立する可能性があります。
- 4
形質転換の前に、結紮DNAサンプルが精製されたことを確認してください。緩衝塩とライゲーション酵素は、挿入されたDNAの形質転換を阻害する可能性があります。また、ライゲーション酵素がライゲーション手順の完了後、熱によって不活性化されたことを確認することも重要です。活性リガーゼは、潜在的に変換を妨害する可能性があります。
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変換に使用される細菌ストックの日付を確認してください。古い細菌細胞は時間の経過とともに効率を失います。最終的には、細菌細胞は変換と品質のクローニングができません。変換のプロセスが診断されたら、ライゲーション手順の分析を開始できます。
トラブルシューティングライゲーション
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結紮前に、DNAサンプルの純度を確認してください。 DNAサンプルの塩汚染物質は、結紮が不十分になる可能性があります。 DNAサンプルには、ライゲーションで使用される前に、塩や酵素がないように精製する必要があります。
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連結されるDNA鎖の端が鈍いか粘着性があるかを確認してください。ライゲーションは、指定された制限酵素で消化した後、鈍い端または粘着性の端と別々の鎖をリンクするために使用されます。 T4 DNAリガーゼは、鈍い末端DNAに最適な酵素ですが、粘着性の端を持つDNAでも機能します。他のDNAリガーゼは、制限ダイジェストに従って粘着性の端を作成するために、DNAに対してのみ機能します。テストしたDNAに適切なリガーゼを使用することが重要です。
- 8
ライゲーション前にDNAサンプルの濃度を確認してください。高濃度のDNAを使用すると、DNAが線形になります。キットの指示は、ライゲーション反応で使用する正しい量のDNAに関する情報を提供します。
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リガーゼ酵素を新しいロットに置き換えます。酵素は室温で特に敏感で、凍結融解サイクルが続きます。リガーゼは、何度も凍結して解凍するだけで、多くの用途に続いて損傷する可能性があります。一部のキットは、リガーゼを最初の使用中に小さな部分にアリコートすることを推奨して、再凍結する回数を減らすことを推奨しています。
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ライゲーションキットを確認してください。多くの場合、ライゲーションの問題は、他のDNAや塩で期限切れまたは汚染されたキットを使用することです。
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