NADHを測定する方法

NADとNADHはどちらも代謝に関与するピリジンヌクレオチドです。 NADHとNADは、細胞の発電所であるミトコンドリアに見られる共酵素です。 NADとNADHは、エネルギーと水素が生成される呼吸や光合成などの細胞反応に関与しています。 NADおよびNADHは、細胞内の主要なエネルギー源であるATPを生成するために多数の酵素を必要とするNADおよび燃料生化学反応。

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必要なもの

• 研究中の細胞または組織
• nadhアッセイキット
• リン酸緩衝生理食塩水
• ドライアイス
• 加熱ブロック
• 96ウェルプレート
• 遠心分離機
• ラベル付きチューブ
• プレートリーダー
• vortex
• nadhの既知の濃度

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手順

1. アッセイ

   • 1

     冷たいリン酸緩衝生理食塩水PBSで研究中の細胞または組織を洗浄します。セルを抽出または抽出バッファーで組織を分解して、ドライアイスに20分間、室温で10分間置きます。繰り返し。

   • 2

     渦10秒間。ペレット細胞または組織の破片に5分間遠心分離機で回転します。上清、液相を取り除き、液体をきれいなチューブに入れます。

   • 3

     特殊なフィルターを介して上清をフィルターして、NADHを分解する酵素を除去します。

   • 4

     200個のマイクロリットルを取り外し、きれいなチューブに入れ、摂氏60度で加熱ブロックで30分間加熱してNADを変性させます。クールで遠心分離機で液相を除去します。 50個のマイクロリットルを96ウェルプレートに移します。各サンプルは、重複または3回である必要があります。総nad、nadtを決定するには、加熱しないでください。

   • 5

     96ウェルプレートにサイクリングミックスを準備して追加します。混合して5分間インキュベートします。 10個のマイクロリットルの開発者を追加し、室温で最大4時間インキュベートするために出発します。停止ソリューションを追加します。キットに応じて、プレートリーダーまたは蛍光計で色の変更を読む

   標準曲線と計算

   • 6

     NADHの既知の濃度を取得し、抽出バッファーで希釈することにより、標準曲線を準備します。異なる濃度に希釈し、終了体積がテストサンプルと同じままであることを確認します。テストサンプルと同じ96ウェルプレートのプレート。光学密度を読みます。

   • 7

     X軸に濃度を備えた標準曲線グラフとY軸に光学密度を描画します。各テストサンプルの平均を取得し、標準曲線グラフから濃度を読み取ります。

   • 8

     NADHからNAD、NADTの合計を差し引き、NADHで割ることにより、NAD/NADH比を計算します。