フローサイトメトリーによる細胞内染色プロトコル

フローサイトメトリーは、細胞内タンパク質を光や蛍光で検出する強力な解析手法です。蛍光標識した抗体やプローブを用いることで、特定タンパク質の発現や局在を定量的に評価できます。本プロトコルでは、細胞内染色の基本的な手順を「固定」「染色」「解析」の3段階に分けて解説します。

1. 細胞の固定

• 細胞内タンパク質の安定性を保つために、まず固定が必要です。ホルムアルデヒドや氷冷アセトンなどの固定剤を使用します。

• 固定後は細胞膜を透過させ、抗体が細胞内に入るようにします。トリトンX-100、NP-40、または氷冷メタノールなどの界面活性剤で膜に孔を開けます。

2. 染色

• まず、0.5% BSA（ウシ血清アルブミン）をPBSで希釈したブロッキングバッファーで細胞を洗浄し、非特異的結合を抑制します。

• ブロッキングバッファーに一次抗体を希釈し、室温で適切な時間インキュベートします。その後、ブロッキングバッファーで洗浄します。

3. 解析

• 蛍光タグで標識した二次抗体を室温で30分間インキュベートします。

• 未結合の抗体はブロッキングバッファーで洗浄し、遠心分離でペレット化した後、PBSに再懸濁してフローサイトメーターで測定します。