細胞凍結保存プロトコル

準備

• 細胞は健康で活発に増殖している状態（生存率90％以上）で凍結することが望ましいです。高速遠心や激しいピペッティング・吸引は避け、取り扱いに注意して細胞の活力を保ちます。

凍結保護

• 凍結保護剤は細胞内の水分に代わる役割を果たし、氷結晶や脱水による損傷を防ぎます。滅菌したグリセロールまたはジメチルスルホキシド（DMSO）を、濃度5〜15％（v/v）で胎牛血清または培地に希釈して使用します。使用する濃度は細胞種により最適化してください。

凍結と保存

• 凍結混合液に入れた細胞はゆっくりと冷却します。プログラマブルフリーザーが無い場合は、クライオバイアルを組織紙で包むか、発泡スチロールに入れて冷却速度を遅くします。まず‑80℃で24時間保存し、その後液体窒素（‑196℃）へ移し長期保存します。

解凍

• 凍結細胞は速やかに解凍します。37℃の水浴槽を使用し、バイアルを素早く取り出します。液体窒素がバイアル内に残っていると解凍時に爆発の危険があるため注意が必要です。解凍後は培地で凍結保護剤を希釈し、トリパンブルー染色で生存率を評価したうえで通常通り培養します。