核酸増幅検査（NAAT）の実施手順

必要なもの

• PCRチューブ
• PCRサイクラー（サーマルサイクラー）
• ピペットとフィルターチップ
• 手袋
• 細胞培養（培養皿）
• Trizol もしくは他のRNA抽出試薬
• PCRバッファー
• Taqポリメラーゼ
• RT‑PCRプライマー（1 mg/ml）
• RNaseフリー水
• dNTP混合液
• MgCl₂
• ランダムプライマー（1.8 mg/ml）
• SuperScript II 逆転写酵素

手順

1. RNAの抽出と処理

   培養皿の各ウェルから細胞を収集し、Trizol（約1 ml）で細胞を破砕します。ピペットで上下に繰り返し混合し、Trizolのマニュアルに従ってクロロホルムで相分離、遠心分離します。上澄みの無色透明なRNA相を回収し、イソプロパノールで沈殿させます。沈殿をエタノールで数回洗浄し、最終的にRNaseフリー水で溶解します。

2. 逆転写（cDNA合成）

   5 µgのRNAを65 ℃で10 µlのRNaseフリー水中で変性させ、すぐに氷上に置きます。各反応は以下の組成で行います：RNA 10 µl、10X PCRバッファー 3 µl、10 mM dNTP 2.5 µl、25 mM MgCl₂ 6 µl、ランダムプライマー（1.8 mg/ml） 1 µl、SuperScript II 0.5 µl、RNaseフリー水で総量を17 µlに調整。室温で10分、続いて42 ℃で1時間インキュベートしcDNAを合成します。95 ℃で短時間加熱し、すぐに氷上で反応を停止させます。

3. PCR増幅

   0.5 mlチューブに以下を混合します：cDNA 6 µl、10X PCRバッファー 1.5 µl、Taqポリメラーゼ 0.2 µl、フォワードプライマー 0.5 µl、リバースプライマー 0.5 µl、RNaseフリー水で総量を10.3 µlに調整。サーマルサイクラーで30サイクル実施します。
   ① 95 ℃で30秒（変性）
   ② 60 ℃で45秒（アニーリング）
   ③ 72 ℃で1分（伸長）