核酸のテスト方法

核酸の検査は、ウイルスや細菌などの病原体を検出するために、医療診断で実施されます。これらの検査ははるかに迅速であるため、通常、より長く退屈な抗体ベースのアッセイを使用して感染の確認を待たなければならなかった患者の治療を開始することができます。このプロセスは、核酸増幅テストとしても知られており、ポリメラーゼ連鎖反応による「逆伝導酵素増幅」として知られる方法が含まれています。これは非常に専門的な科学的手順であるため、分子生物学の技術と理論の高度な知識と専門知識が必要です。

<ヘッダー>

必要なもの

• pcrチューブ
• pcr cycler
• ピペットとフィルターのヒント
• グローブ
• セル
• trizolまたはその他のRNA抽出試薬
• pcrバッファー
• taqポリメラーゼ
• 1 mg/ml濃度でのRT-PCRプライマー
• rnaseフリーの水
• dntps
• mgcl2
• 1.8 mg/ml濃度でのランダムプライマー
• superScript II逆転写酵素

もっと見せてください

手順

1. RNAの処理と調製

   • 1

     TrizolなどのRNA抽出試薬を含む細胞を収穫します。 1 mlは、6ウェル組織培養プレートの1つの井戸から細胞を収集するのに十分です。セルは、それらを均質化してから、TRIZOLデータシートに記載されているように抽出手順を実行するために、上下に徹底的にピペットされています。簡単に言えば、クロロホルムで抽出し、次に遠心分離してDNA、タンパク質、RNAの相を分離します。無色のRNA相のみを回収し、イソプロパノールでそれを沈殿させます。インキュベーション後、それを遠心分離し、結果のペレットをいくつかのエタノール洗浄でクリーンアップします。次に、RNaseを含まない水でペレットを再懸濁します。

   • 2

     逆転写のために、10ミクロリットル（UL）のRNaseを含まない水で摂氏65度のRNAを正確に5マイクログラムのRNAに変換し、すぐに氷の上に置きます。各反応について、10 ULのRNA、3 ULの10x PCR反応バッファー、2.5 ULの10ミリモルDNTP、6 Lの25ミリモルマグネシウム塩化物、1ミリリットル濃度1.8ミリグラム1.8ミリグラムのランダムプライマー1、および0.5 ULのSuperScript II逆転写酵素を組み合わせます。各反応を17 ULのRNaseを含まない水で補充します。チューブを室温で10分間、次に摂氏42度で1時間cDNAし、95度で摂氏95度に変性し、反応を止めるために氷をすばやく氷にします。

   • 3

     ポリメラーゼ連鎖反応の場合、逆転写反応で作られた6 ULのcDNA、10x PCR反応バッファー1.5 ULのcDNA、0.2マイクロリットルの逆プライマー、前方プライマーの0.5マイクロリットル、10.3 ULの各チューブをRNASEFREE水の10.3 ULの上に組み合わせることにより、再び0.5 mLチューブに反応混合物を設定します。反応を実行するには、次のように30サイクルの熱サイクラー（つまり、ポリメラーゼ鎖反応を実行する機械）をセットアップします：95℃、0.5分間、摂氏60度45秒間、アニールを45秒間、最後に1分間摂氏72度を1分間拡張します。