分子クローニングプロトコル

分子クローニングプロトコルには、DNA配列の定義、分離、および複製に使用される手順を含みます。従来の制限およびライゲーションクローニングプロトコルは、制限されたエンドヌクレアーゼ（制限部位でDNA鎖を切断する酵素）、DNA断片的ライゲーション（DNA分子の不連続性の修復）、透過（細胞肉への核酸の導入）、および選択（個々のゲノムの選択）でDNA断片化を開始します。

1. 分離

   • 分子クローニングの最初のステップであるDNAフラグメントの分離のためのプロトコルには、多くの場合、ポリメラーゼ連鎖反応（PMR）が組み込まれています。目標シーケンスサイズに到達するために、他のプロトコルには、DNA超音波処理、反応酵素消化、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの使用が含まれます。これらのプロトコルは、必要な分離DNAの大きさと量によって異なります。

   ライゲーション

   • ライゲーションのプロトコルには、酵素であるDNAリガーゼを使用して、共有結合と一緒にDNA分子を結合することが含まれます。プロトコルは、DNAフラグメント、クローニングベクター、ライゲーションバッファー、DNAリガーゼ、滅菌水をミクロ中心性チューブに組み合わせ、摂氏4度で一晩インキュベートすることを決定します。

   トランスフェクション

   • トランスフェクションのプロトコル、または非ウイルス平均を使用してDNAを細胞に注入することは、多くの場合、細胞細胞質にDNAを直接注入することを伴います。その他の方法には、リン酸カルシウムや脂質などの化学試薬を使用して、細胞膜を介してトランスフェクション複合体を供給することが含まれます。この方法は、特定の遺伝子の機能に対する遺伝子修飾の効果をテストします。

   選択

   • 選択、またはスクリーニング、プロトコルは、どの細胞がDNAインサートを正常に保持しているかを決定し、どの細胞が分離が必要かを示します。遠心分離機は、トランスフェクトされたDNAを含む細胞を採取し、リゾチーム（天然に存在する酵素）バッファーでインキュベートし、アルカリ洗剤で処理し、タンパク質と膜の溶解度を与えます。アセテートを使用してタンパク質を沈殿させると、遠心分離機とチーズクロスがDNAを含む上清（遠心分離化合物から残っている可溶性液体）をろ過します。上清をポリエチレングリコールで沈殿させ、遠心分離し、塩化セシウムおよび臭化エチジウムで懸濁します。臭化エチジウムは密度に応じてDNAを染色し、長波紫外線を使用して、下帯DNAを5 ccシリンジで抽出します。平衡化イオン交換カラムは、DNAを臭化エチジウムと塩化エチジウムと分離し、最終的なDNAペレットを緩衝液に懸濁し、アガロースゲル電気泳動で検出されます。