分子クローニングの手順

分子クローニングの概要

分子クローニングは、特定のDNA配列を定義・単離・増幅する一連の手順です。従来の制限酵素とリガーゼを用いた手法では、DNAの切断、リガーション、形質転換、選別が行われます。

1. DNAの単離

単離の第一段階として、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて目的配列を増幅します。必要に応じて、DNA超音波破砕、酵素消化、化学合成オリゴヌクレオチドの使用などが加えられます。単離量やサイズに応じて手法を選択します。

2. リガーション（DNA結合）

DNAリガーゼを用いて、DNA断片とクローニングベクターを共有結合で連結します。反応は、DNA断片、ベクター、リガーションバッファー、リガーゼ、無菌水をチューブに混合し、4℃で一晩培養します。

3. 形質転換（トランスフェクション）

DNAを細胞に導入する方法として、化学的手段（カルシウムリン酸法、リポフェクション）や電気穿孔法があります。非ウイルス性の手法では、DNAを直接細胞質へ注入することもあります。導入後、目的遺伝子の機能変化を評価します。

4. 選別（スクリーニング）

導入されたDNAを保持した細胞を選別します。培養後、抗生物質耐性や蛍光マーカーなどの選択マーカーで生存細胞を絞り込み、コロニーをピックアップします。最終的に、抽出したプラスミドDNAはアガロースゲル電気泳動で確認します。