QuikChange変異導入プロトコル

QuikChangeミューテーゼは、遺伝子変異やDNA改変を行うためのキットで、Agilent Technologiesが提供しています。現在は「QuikChange II」と「QuikChange Lightning」の2種類があり、バッファー、DNAポリメラーゼ、色素試薬、プライマー（オリゴヌクレオチド）およびコンピテントセルが同梱されています。

変異鎖合成反応プロトコル

1. 目的の変異を含む2本のオリゴヌクレオチド（短いDNA配列）を設計し合成します。

   DNAシーケンス、dNTPミックス、DNAポリメラーゼを含むコントロール反応液を作り、蒸留水で容量を調整します。

   メーカーの指示に従い、二本鎖DNA（dsDNA）の濃度を変えたサンプル反応を作成し、プライマー濃度は一定に保ちます。

   反応は95℃（203°F）で30秒間加熱し、その後氷上で2分間冷却します。

   DNAセグメント2を含むサンプルは、温度サイクリング（短時間で温度を変化させる）でも処理します。

DpnI消化プロトコル（増幅産物の処理）

1. DpnI制限酵素はメチル化された親DNAを特異的に切断します。各増幅反応に対して1µLのDpnIを直接添加し、ミネラルオイルで覆います（熱サイクラーにホットトップが無い場合のみ必要）。

   軽く混合した後、1分間遠心し、続いて37℃（98.6°F）で1時間インキュベートします。

XL1-Blueスーパーコンピテントセルへの形質転換プロトコル

1. QuikChangeキットに同梱されているテトラサイクリン耐性のXL1-Blueセルを使用します。-80℃（-112°F）で保存されたセルを氷上で解凍します。

   DpnI処理済みDNA（1µL）を加え、42℃（107.6°F）で45秒間熱処理した後、氷上で2分間冷却します。

   続いて、42℃で予熱したNZY培地（カゼイン加水分解物＋酵母エキス）を加え、1時間培養します。

   培養後、寒天培地に塗布し、37℃（98.6°F）で16時間インキュベートしてコロニーを形成させます。