QuikChange変異誘発プロトコル

QuikChange変異誘発は、遺伝的突然変異またはDNAの変化を誘導するためにバイオテクノロジー研究で使用されるキットのブランド名です。 Agilent Technologiesは製品の背後にある会社であり、2つのバージョン、Quikchange IIとQuikchange Lightningがあります。どちらのキットにも、バッファー溶液、酵素DNAポリメラーゼ、色試薬、DNA配列またはプライマー、および細胞サンプルが含まれています。

1. 変異鎖合成反応プロトコル

   • 技術者は、目的の変異を含む2つのオリゴヌクレオチドまたは短いDNA配列を合成します。次に、DNA配列、DNTP混合溶液、およびDNAポリメラーゼ酵素でコントロール反応を調製し、蒸留水を加えます。その後、メーカーの指示に従って、プライマーまたはオリゴヌクレオチド濃度を一定に保ちながら、さまざまな濃度の二本鎖DNA（DSDNA）を使用して一連のサンプル反応を準備します。サンプルは203度Fに30秒間保持します。 DNAセグメント番号2を含むサンプルは、温度サイクリングでテストされています。これは、短い時間に温度が変化する技術です。最後に、サンプルは2分間氷上に置かれます。

   DPN I Amplification Products Protocol の消化

   • DPN I制限酵素は特定の部位でDNAを切断します。この酵素の1つのマイクロリターは、マイクロピペットまたは特殊なエアロゾル耐性ピペットチップを使用して、標準のミネラルオイルオーバーレイの下の各増幅反応に直接加えられます。ただし、ミネラルオイルオーバーレイは、DNAセグメントを増幅するために使用される装置であるサーマルサイクラーがホットトップアセンブリを持っていない場合にのみ必要です。反応は穏やかに混合され、後に1分間微量遠心に入れられます。その後、サンプルは98.6度Fで1時間インキュベートされます。

   XL1-Blue SuperCompetent細胞プロトコルの変換

   • XL1-Blueは、キックチャンジ変異誘発キットに付属するテトラサイクリン耐性細胞株です。このプロトコル中、技術者は以前に氷上で-112度に保たれていた細胞を解凍しました。次に、DPN I処理DNAの1つのマイクロリットルを追加し、45秒間107.6度Fに加熱し、2分間氷上に反応を置きます。この手順の後、技術者はNZY（カゼイン加水分解物と酵母抽出物）の準備を107.6度まで予熱し、1時間インキュベートします。その後、準備は寒天ゲルプレートに置かれ、98.6度Fで16時間インキュベートします。