カタラーゼ濃度測定手順

概要

カタラーゼは生体内で働く有機触媒で、最も強力な酵素のひとつです。過酸化水素は代謝過程で生成される有毒な副産物ですが、カタラーゼはこれを水と酸素に分解し、細胞を保護します。また、フェノール類や蟻酸、ホルムアルデヒド、アルコール類などの酸化にも関与します。

必要なもの

• リン酸緩衝液中のクロモゲン 110 mL を2本
• 30 %過酸化水素基質 300 µL
• リン酸緩衝液中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） 400 µL
• リン酸緩衝液 60 mL
• リン酸緩衝液中のサンプル希釈剤（界面活性剤） 250 mL
• リン酸緩衝液中の基質希釈液 30 mL を2本
• ナトリウムアジド停止試薬 30 mL を2本
• 標準カタラーゼ 160 U/バイアル のバイアル 2本
• 分光光度計
• 10 µL 可変ピペット
• 光路長1 cm の分光セル
• キャップ付きポリプロピレンマイクロチューブ 1.5 mL
• 試験管（直径12 mm、長さ75 mm、容量2.5 mL）
• タイマー
• 脱イオン水

手順

1. 測定用のカタラーゼ標準液を作ります。50 mL バイアルにカタラーゼ（濃度160 U/mL）を入れ、脱イオン水200 µLを加えて混合します。
2. 希釈したカタラーゼ30 µLを各チューブに加え、続いて基質（10 mM 過酸化水素）500 µLを加えます。過酸化水素は取り扱いに注意してください。
3. 各チューブを室温で1分間インキュベートします。
4. 各バイアルに試薬500 µLを加え、キャップを閉じて上下に逆さに振って混合します。撹拌やシェイクは行わないでください。
5. 反応混合液を各試験管に20 µL移し、HRP試薬を2 mL加えます。その後、試験管を数回上下に逆さに振って混合します。
6. 再度、室温で10分間インキュベートします。
7. 分光光度計で吸光度を測定します。分光光度計は光の波長を測定し、試料中の物質と濃度を定量します。この手順によりカタラーゼ活性を正確に評価でき、過酸化水素との相互作用を把握する上で有用です。